Comme beaucoup d’autres animaux, les chauves-souris ont quelques prédateurs, même si elles sont quasiment en bout de chaîne alimentaire.
C’est le cas de la Chouette Hulotte, et de la Chouette Effraie, parmi lesquelles certains individus se sont spécialisés dans la chasse des chauves-souris. D’autres espèces se sont ainsi concentrées sur ces animaux, comme le Faucon Hobereau, qui a la particularité de chasser et de rechercher les chauves-souris qui sortent des gîtes à la tombée de la nuit. D’autres encore peuvent aussi créer quelques difficultés : c’est le cas de la Fouine, de la Martre en forêt, qui viennent parfois dénicher les chauves-souris à l’intérieur des arbres creux. Bien sûr, si elles sont aussi soumises aux parasites et aux maladies, c’est finalement l’Homme qui cause le plus de dégâts sur les populations. Parmi les causes principales de leur raréfaction, il est évident que l’utilisation depuis quelques décennies d’insecticides et autres pesticides, provoque des empoisonnements indirects, dans la mesure où on réduit la capacité alimentaire du milieu dans lequel elles vivent. Elles trouvent de moins en moins de proies. De plus, les produits phytosanitaires utilisés provoquent parfois des intoxications chez les animaux qui les ingèrent en mangeant des proies contaminées.
L’uniformisation des paysages est aussi une cause essentielle dans la disparition des chiroptères. L’élimination des haies, des bosquets, des broussailles, entraîne par endroits la disparition de certaines espèces ou de leurs populations (cas des Rhinolophes, dont le milieu bocagé est indispensable à leur survie), tout comme la destruction des gîtes par la démolition des ruines, la modernisation des vieux bâtiments, la fermeture hermétique des greniers ou des clochers pour empêcher l’occupation du site par les pigeons, la fermeture des caves, l’abattage des arbres creux ou des vieux arbres. L’emploi dans les greniers ou sur les charpentes de produits d’imprégnation, qui permettent d’empêcher la pourriture ou les attaques par les insectes, provoque des intoxications (les animaux se frottent contre les charpentes, se lèchent pendant leur toilette, et ingèrent ainsi les produits toxiques). Les dérangements incessants dans les grottes en hiver, sont aussi la cause de nombreuses disparitions.
Enfin, les accidents sur le bord des routes peuvent aussi générer des diminutions de population. On considère que, sur une route départementale, une chauve-souris par kilomètre et par an est percutée par un véhicule.
Dernier point, les conditions climatiques défavorables peuvent aussi entraîner des diminutions de population, dans la mesure où des températures très basses et une météo très humide pendant un été peuvent engendrer la mortalité de la plupart des jeunes de l’année (cas de l’été 2000 ou plus de 60 à 70% des jeunes chez les Rhinolophes sont morts pendant l’été).